Открыт альтернативный принцип работы биологических часов

Цианобактерии со встроенным светящимся белком, выработка которого зависит от экспрессии часовых генов (генов — регуляторов суточных ритмов). Такая методика позволяет исследовать работу циркадных механизмов у живых клеток. Фото с сайта www.vanderbilt.edu

Известно, что биохимические процессы в клетке синхронизируются и упорядочиваются, сверяясь с генными часами: специальные «часовые гены» задают ритмичность процессов жизнедеятельности с периодом в 24 часа. Но оказалось, что и без таких генных механизмов в клетке поддерживается циклическая динамика биохимических процессов. И период этих циклов также составляет 24 часа. Биохимические часы обнаружены и у одноклеточных животных, и в клетках человеческих тканей. Вероятно, биохимические осцилляции сами по себе способны поддерживать организующую ритмичность. Открытый тип внутренних биологических часов является совершенно новой страницей в исследовании эволюции циркадных механизмов.

Мы понимаем, что любой динамический процесс обладает протяженностью, то есть отсчитывает свое внутреннее время. Я не буду заниматься спекуляциями относительно определения понятия «времени», но отмечу, что наше биологические время определяется несколькими способами. Мы пользуемся эволюционным временем, измеряемым относительно геологических процессов нашей планеты, мы пользуемся историческим временем — это столетия и годы, то есть время астрономическое, время вращения Земли вокруг Солнца; в повседневности нас устраивают часы, минуты и секунды — доли астрономического времени, приведенные в соответствие с электрическими ритмами, например, кварца, или даже атомные часы, задающие миллионные доли секунд за счет собственных молекулярных колебаний.

Наше тело живет в согласии со своим биологическим временем, которое зависит от числа клеточных делений и дупликаций хромосом в клетках; биологическое время поделено на свои «часы и минуты», определяемые внешними ритмами: сменой дня и ночи или температурными ритмами и т. д. Имеются специальные механизмы синхронизации биологического времени с внешними ритмами, записанные для удобства в генах. Но, кроме того, есть еще и «биохимическое время» — время, определяемое течением биохимических процессов. Оно имеет весьма высокое разрешение по сравнению с биологическими часами и минутами. Соответственно, необходим некий дирижер, который бы этот биохимический хаос организовал в слаженный оркестр, удовлетворяющий запросам «медленного» тела. Ясно, что требования к дирижеру предъявляются высокие — он должен уметь уследить и за биохимическим временем (собственно, всё определяется биохимией, но здесь я употребляю это наименование в смысле процессов, происходящих в цитоплазме клетки, а не в ядре, то есть не связанных с генами), и за телесным.

Считалось, что роль такого дирижера выполняет набор часовых генов. Для организации генных часов необходимо отладить петлю обратной связи: экспрессия гена приводит к выработке фермента, ингибирующего его работу. В результате производство этого фермента прекращается, накопленный его запас распадается, запрет на работу гена снимается и ген снова начинает производство ингибитора. В действительности, таких часовых генов не один, а много, и их задача — синхронизировать работу биохимического аппарата внутри себя и в согласии с внешними ритмам. Здесь отмечу, что гены, задействованные в организации внутренних часов, не гомологичны у разных групп живых организмов.

Однако генный метроном не обладает достаточным разрешением для организации ансамблей биохимических реакций: его временной масштаб — часы и сутки. Тут нужен кандидат из мира биохимии. До настоящего времени таких кандидатов не было известно, расшифровке поддавались в основном генные механизмы поддержания синхронности и ритмичности процессов жизнедеятельности. Но кое-какие данные говорили о том, что невидимый биохимический дирижер (или несколько) в клетке всё же работает, суточные ритмы поддерживаются и в том случае, если гены не считываются и не транслируются. Это показало, например, недавнее исследование выделенных цианобактериальных белков, поддерживающих ритмичную работу в пробирке (см. M. Nakajima, et al. Reconstitution of Circadian Oscillation of Cyanobacterial KaiC Phosphorylation in Vitro // Science. V. 308. P. 414-415. 15 April 2005). Так что это за биохимический метроном?

Его исследованию посвящены две новые работы, выполненные английскими и французскими учеными под руководством Джона О’Нила, представляющего Кембриджский университет и эдинбургский Центр системной биологии. В обеих показано поддержание суточных ритмов без внешней стимуляции и при остановке транскрипции ядерных генов. Второе условие призвано доказать наличие естественного ритма, не зависящего от генетического содержания.

Создать в лаборатории условия, в которых отсутствуют внешние стимулы, несложно: задать постоянную температуру и освещение — вот и вся хитрость.

Труднее остановить транскрипцию часовых генов. Но и тут ученые нашли выход. В первом случае, работая с одноклеточной зеленой водорослью Ostreococcus tauri, они остановили транскрипцию с помощью специальных фармакологических ингибиторов. Во втором случае они выбрали такой объект для исследований, в котором никакой транскрипции и не предполагалось, — зрелые эритроциты человека. Как известно, в эритроцитах человека клеточного ядра нет вообще, а значит, и транскрипции ядерных генов тоже нет.

Первая серия экспериментов базировалась на изучении искусственной (генно-инженерного происхождения) биолюминесценции зеленой водоросли Ostreococcus. Выработка биолюминесцентных белков у этой водоросли была увязана с экспрессией циркадного гена CCA1 (этот ген у водоросли во многом общий с высшими растениями, а активные центры у них вообще идентичны). Это означает, что интенсивность свечения клеток укажет на активность гена CCA1. Такая генно-инженерная клетка чрезвычайно удобна для изучения циркадных механизмов — нет нужды делать множественные серии культур и убивать часть из них по ходу эксперимента; помимо того, отслеживать работу гена гораздо легче — это можно делать буквально на глаз.

Если подготовленную биолюминесцентную водоросль выдерживать на постоянном свету, то ритмичное свечение через 36 часов останавливается.

Естественно, то же самое получается и при выдерживании клеток в темноте: клетки перестают светиться тоже через 36 часов. А теперь клетки из темноты снова вынесли на свет — ритмичная биолюминесценция возобновляется. Но важная особенность новых ритмов в том, что они имеют собственную фазу колебаний. Когда бы ни выставили на свет водорослевую культуру, свечение стартует будто бы с учетом прежней ритмики. Похоже, что внутренний ритм поддерживался и тогда, когда часовые гены CCA1 прекратили работать. Также элементы внутренней активности часов обнаружились и при остановке транскрипции и трансляции специальными химикатами: транскрипция останавливалась кордицепином (cordycepin), трансляция — циклогексимидом (cycloheximide). Если ввести в культуру эти химикаты, а потом отмыть клетки от них (клетки удобно прилипают к дну чашки Петри, так что химикаты удаляются, а клетки остаются), то свечение будет восстанавливаться. Но фаза ритмов снова ненапрямую зависит от времени прекращения действия химикатов, указывая на существования биохимических ритмов.

Наличие внутренних циркадных ритмов, не зависящих от ядерных генов, удалось подтвердить напрямую. Для этого в эксперименте с подавлением транскрипции и трансляции отслеживали динамику других цитоплазматических маркеров. Ясно, что биолюминесценция, связанная с генами, остановилась.

Зато нашлись другие вещества, которые в этих условиях сохраняли ритмическую динамику биохимических переходов одних своих форм в другие. Речь идет о пероксиредоксинах (peroxiredoxin). Это очень широко распространенные ферменты, которые участвуют в восстановлении перекисных остатков.

В результате реакций восстановления сами пероксиредоксины образуют димеры — именно их и отслеживали в ходе эксперимента с Ostreococcus, оценивая уровень активности пероксиредоксинов. Оказалось, что активность пероксиредоксинов в постоянных условиях и при неработающих генах сохраняет цикличность с периодом в 24 часа.

Другая серия экспериментов была связана с изучением динамики биохимических процессов в эритроцитах. Эритроциты, красные клетки крови человека, очевидно, функционируют вне прямой зависимости от освещенности. Поэтому для установления клеточных ритмов препараты выдерживали в постоянных температурных условиях и в темноте. У этих клеток нет ядра, следовательно нет генетической регуляции циркадных ритмов. Если при этом учесть, что клетки культивировали в искусственной химической среде, то любая обнаруженная биохимическая ритмичность может быть отнесена только на счет негенетических, или биохимических, механизмов.

Английские ученые (а в этом исследовании принимали участие только специалисты из Кембриджа) отследили периодичность окисленных и восстановленных формах пероксиредоксинов. Ритм изменений составил 24 часа. Если в эксперименте задать циклическую смену температуры (считалось, что для эритроцитов циркадными стимулами являются утренне-вечерние колебания температуры тела), то ритмы пероксиредоксинов сдвигаются в соответствии с заданной температурной ритмичностью. Суточная ритмика прослеживается и для других компонентов эритроцитов — НАДФН/НАДН, ди- и тетрамеров гемоглобина.

Таким образом, пероксиредоксины демонстрируют суточную ритмичность окислительной и восстановительной активности и у одноклеточных зеленых водорослей, и в человеческих клетках. Возможно, что негенные механизмы поддержания суточной ритмики вообще более единообразны, чем генные — ведь пероксиредоксины имеются и у растений, и у животных, и у одноклеточных водорослей, и у бактерий. И эти ферменты весьма консервативны по сравнению с часовыми генами.

Пока нельзя сказать, являются ли пероксиредоксины ключевым звеном биохимических часов или одним из зависимых ферментов «часовых» реакций, но так или иначе, они напрямую указывают на работу таких реакций. Авторы исследования предполагают, что именно подобные им вещества и были самым первым хронометром для живых организмов на нашей планете. Они могли организовывать слаженную работу многих биохимических путей, а генные механизмы постепенно подлаживались к заданной биохимической ритмике, в каждой группе животных с учетом собственных нужд и жизненных циклов.

Источники:
1) John S. O’Neill, Gerben van Ooijen, Laura E. Dixon, Carl Troein, Florence Corellou, François-Yves Bouget, Akhilesh B. Reddy, Andrew J. Millar. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote // Nature. V. 469. P. 554–558. 27 January 2011. DOI: doi:10.1038/nature09654.
2) John S. O’Neill, Akhilesh B. Reddy. Circadian clocks in human red blood cells // Nature. V. 469. P. 498–503. 27 January 2011. DOI: doi:10.1038/nature09702.
3) Gretchen Vogel. Telling Time Without Turning On Genes // Science. V. 331. P. 391. 28 January 2011. DOI: 10.1126/science.331.6016.391.
4) Суточные ритмы — превосходный и краткий обзор регуляции суточных ритмов у разных царств (и типов соответственно) живых организмов, выполненный в Институте цитологии и генетики СО РАН.

Елена Наймарк